Ангстрем

Nature, том 617, страницы 711–716 (2023 г.) Процитировать эту статью

60 тысяч доступов

506 Альтметрика

Подробности о метриках

Флуоресцентная микроскопия с ее молекулярной специфичностью является одним из основных методов определения характеристик, используемых в науках о жизни для понимания сложных биологических систем. Подходы со сверхразрешением1,2,3,4,5,6 позволяют достичь разрешения в клетках в диапазоне от 15 до 20 нм, но взаимодействия между отдельными биомолекулами происходят на масштабах длины ниже 10 нм, и для характеристики внутримолекулярной структуры требуется разрешение Ангстрема. Современные реализации сверхвысокого разрешения7,8,9,10,11,12,13,14 продемонстрировали пространственное разрешение до 5 нм и точность локализации до 1 нм в определенных условиях in vitro. Однако такое разрешение напрямую не применимо к экспериментам на клетках, а разрешение Ангстрема до сих пор не было продемонстрировано. Здесь мы представляем метод ДНК-штрих-кодирования, повышение разрешения путем последовательной визуализации (RESI), который улучшает разрешение флуоресцентной микроскопии до шкалы Ангстрема с использованием стандартного оборудования и реагентов для флуоресцентной микроскопии. Последовательно визуализируя разреженные целевые подмножества при умеренном пространственном разрешении > 15 нм, мы демонстрируем, что разрешение одного белка может быть достигнуто для биомолекул в целых интактных клетках. Кроме того, мы экспериментально определяем расстояние между отдельными основаниями основной цепи ДНК в ДНК-оригами с разрешением Ангстрема. Мы используем наш метод для демонстрации принципа действия для картирования молекулярного расположения мишени иммунотерапии CD20 in situ в необработанных и обработанных лекарствами клетках, что открывает возможности для оценки молекулярных механизмов таргетной иммунотерапии. Эти наблюдения показывают, что, обеспечивая внутримолекулярную визуализацию в условиях окружающей среды целых интактных клеток, RESI закрывает разрыв между микроскопией сверхвысокого разрешения и исследованиями структурной биологии и, таким образом, предоставляет информацию, ключевую к пониманию сложных биологических систем.

Точность локализации (σSMLM) целевой молекулы в широкопольной локализационной микроскопии одиночных молекул (SMLM)15 в конечном итоге и фундаментально ограничена количеством фотонов (N), собираемых за одно мигание: \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF — стандартное отклонение функции рассеяния точки (PSF) оптического система визуализации16, рис. 1а). Множественные локализации одной и той же цели (рис. 1б, вверху) распределяются вокруг истинного положения из-за их конечной точности. Две или более точки, неразрешимые с помощью SMLM, создают перекрывающиеся распределения локализаций, что исключает однозначное присвоение локализаций соответствующим целям (рис. 1б, внизу). Однако если бы каждую локализацию можно было отнести к конкретной мишени по цвету, штрих-коду или любой другой молекулярной идентичности, их можно было бы однозначно сгруппировать по мишеням2.

а, В SMLM, σSMLM одного красителя масштабируется с \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\, что в конечном итоге ограничивает достижимое пространственное разрешение. б, подходы SMLM, такие как DNA-PAINT, имеют пространственное разрешение примерно 10 нм (разрешение приблизительно соответствует полной ширине на полувысоте ≈ 2,35 σSMLM). В то время как цели, расположенные на расстоянии 20 нм (d1), таким образом, могут быть легко разрешены, объекты, расположенные на расстоянии 2 нм друг от друга (d2), неразрешимы, поскольку результирующие распределения локализаций перекрываются. c. Используя ортогональные последовательности ДНК (синие и зеленые) и последовательное получение, как в Exchange-PAINT, локализации от целей, расположенных ближе, чем предел разрешения SMLM, могут быть однозначно назначены для каждой цели. d. Объединение всех локализаций на мишень (K) для каждого раунда визуализации повышает точность локализации от sd (σSMLM) до sem (σRESI). д. Поскольку сверхвысокое разрешение произвело революцию во флуоресцентной микроскопии, RESI приводит к еще одному сдвигу парадигмы, повторно применяя концепцию локализации к данным сверхвысокого разрешения. f, точность локализации в RESI масштабируется с помощью \(\frac{1}{\sqrt{K}}\), и, таким образом, улучшение разрешения в RESI не зависит от σSMLM, достигая точности локализации по шкале Ангстрема.